藥品原料藥和制劑的生產(chǎn)過(guò)程中，不可避免地會(huì)產(chǎn)生或引入影響藥物穩(wěn)定性甚至威脅人類(lèi)健康的雜質(zhì)，比如在血管緊張素受體拮抗劑 (ARB)、雷尼替丁及其他藥物中發(fā)現(xiàn)潛在致癌物-亞硝胺雜質(zhì)。1987年亞硝胺類(lèi)化合物（NAs）被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）列入致癌物清單，2017年國(guó)際人用藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）評(píng)估和控制藥物中DNA反應(yīng)性（致突變）雜質(zhì)的ICH M7指導(dǎo)原則將致癌風(fēng)險(xiǎn)高的NAs列為“關(guān)注隊(duì)列”。
在酸性條件下，若仲胺、叔胺或季胺和亞硝酸鹽同時(shí)存在，則有可能形成亞硝胺。藥物原料藥生產(chǎn)過(guò)程中采用的起始原料、試劑、催化劑、溶劑、中間體以及被污染的設(shè)備和試劑都有可能造成亞硝胺雜質(zhì)的生成。此外，藥物制劑過(guò)程中采用的輔料以及藥物因儲(chǔ)藏條件而發(fā)生氧化、分解等反應(yīng)也會(huì)在藥物中引入亞硝胺雜質(zhì)。其中有機(jī)溶劑在API生產(chǎn)及藥品的分離、純化過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，根據(jù)FDA（美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局）和EMA（歐洲藥品監(jiān)督管理局）的指導(dǎo)原則，藥品生產(chǎn)過(guò)程中使用的有機(jī)溶劑是亞硝胺雜質(zhì)的潛在根源之一。因此對(duì)藥物及藥品生產(chǎn)使用有機(jī)溶劑中亞硝胺類(lèi)雜質(zhì)的種類(lèi)、含量測(cè)定和成因分析，近年來(lái)已成為制藥行業(yè)關(guān)注的要點(diǎn)。
為應(yīng)對(duì)亞硝胺危機(jī)，USP（美國(guó)藥典委員會(huì)）經(jīng)方法測(cè)試及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估后建立了幾個(gè)亞硝胺參考標(biāo)準(zhǔn)，并發(fā)布了新的《美國(guó)藥典—國(guó)家處方集(USP-NF) 》通則<1469>亞硝胺雜質(zhì)，以支持行業(yè)分析和監(jiān)測(cè)藥品供應(yīng)鏈中的亞硝胺。2020年版《中國(guó)藥典》四部通則9306亦有體現(xiàn)，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心并于2020年5月8日發(fā)布了《化學(xué)藥物中亞硝胺類(lèi)雜質(zhì)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》的通告（2020年1號(hào)）。
FDA曾報(bào)告了一種采用GC-MS/MS結(jié)合直接進(jìn)樣的方法測(cè)定有機(jī)溶劑中NDMA、NDEA、NEIPA、NDIPA和NDBA等亞硝胺雜質(zhì)，但對(duì)于未知雜質(zhì)較多的商用級(jí)溶劑的分析中，對(duì)于未知雜質(zhì)干擾的排除及未知雜質(zhì)與亞硝胺雜質(zhì)峰的分離度方面還面臨一些挑戰(zhàn)?；诖耍琔SP使用島津高靈敏度GCMS-TQ8050 NX三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)開(kāi)發(fā)了一種高靈敏度的GC-MS/MS分析方法，用于二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯和鄰二甲苯溶劑中同時(shí)測(cè)定六種亞硝胺雜質(zhì)(NDMA、NDEA、NEIPA、NDIPA、NDPA和NDBA)，并驗(yàn)證了該方法的有效性。
儀器和分析條件
溶液和樣品制備
注：所有溶液均在棕色容量瓶中配制
結(jié)果與討論
1.方法開(kāi)發(fā)
商用溶劑中存在較多的干擾雜質(zhì)以至于影響亞硝胺的準(zhǔn)備識(shí)別，通過(guò)優(yōu)化MRM離子對(duì)、碰撞能量以減少未知雜質(zhì)的干擾（MRM條件優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)下表1），此外對(duì)柱溫程序也進(jìn)行優(yōu)化，并改變檢測(cè)器增益（0.8kv）以提高方法的靈敏度（相對(duì)于商用溶劑樣品濃度達(dá)到100 ppb）。同時(shí)對(duì)于樣品濃度，經(jīng)測(cè)試樣品濃度為25 mg/mL時(shí)可以減少干擾并保持高的靈敏度。由于亞硝胺的原位形成，GCMS使用的高溫可能會(huì)導(dǎo)致亞硝胺測(cè)試結(jié)果偏高。通過(guò)空白進(jìn)樣，未觀察到亞硝胺出峰位置有干擾。此外室溫下48h穩(wěn)定性測(cè)試亦未發(fā)現(xiàn)亞硝胺雜質(zhì)發(fā)生變化。
進(jìn)一步使用分析級(jí)溶劑對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證，再次證實(shí)了原FDA方法商用溶劑中未知雜質(zhì)影響了分析方法的靈敏度，其中相對(duì)于100 mg/mL的樣品濃度NDMA、NDEA、NEIPA、NDIPA、NDPA的LOQ為5 ppb，NDBA的LOQ為13 ppb。與FDA報(bào)道的方法相比，優(yōu)化后的方法對(duì)不同純度溶劑樣品中亞硝胺的分析具有良好的分離度和高靈敏度。
表1 6種亞硝胺的MRM條件（離子對(duì)、CE值、掃描時(shí)間）
注：N-亞硝基二甲胺（NDMA）、N-亞硝基二乙胺（NDEA）、N-亞硝基乙基異丙基胺（NEIPA）、N-亞硝基二異丙胺（NDIPA）、N-亞硝基二苯胺（NDPA）、N-亞硝基二丁胺（NDBA）
2.方法學(xué)驗(yàn)證
用所建立的GC-MS/MS方法對(duì)二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯和鄰二甲苯等商用溶劑和分析級(jí)溶劑中的6種亞硝胺進(jìn)行測(cè)定，驗(yàn)證標(biāo)液濃度完全覆蓋FDA相關(guān)限值要求，通過(guò)色譜分離專(zhuān)屬性、線性、準(zhǔn)確度、重復(fù)性、中間準(zhǔn)確度等多個(gè)指標(biāo)驗(yàn)證了該方法的可靠性。驗(yàn)證方法及結(jié)果分見(jiàn)表2和圖2 。
表2 方法學(xué)驗(yàn)證程序及結(jié)果
RLL-低濃度水平加標(biāo)回收率（5 ppb* (NDMA、NDEA、NEIPA、NDIPA、NDPA)和13 ppb*(NDBA) ）
RML-中濃度水平加標(biāo)回收率（1000 ppb* ）
RUL-高濃度水平加標(biāo)回收率（2000 ppb*）
*：相對(duì)于100 mg/mL的樣品濃度
圖2 （A) LOQ溶液色譜圖 （0.5 ng/mL (NDMA、NDEA、NEIPA、NDIPA、NDPA)和1.3 ng/mL (NDBA)）
(B) MRM-1和MRM-2提取離子色譜圖
3.樣品分析
使用經(jīng)驗(yàn)證的方法對(duì)二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯和鄰二甲苯等商用溶劑進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲苯被550 ppb的NDEA污染，鄰二甲苯被120 ppb的NDEA和3400 ppb的NDBA污染。在上述商用溶劑和其他分析級(jí)的二氯甲烷和乙酸乙酯溶劑中未檢測(cè)到亞硝胺。
總結(jié)
溶劑在制藥工業(yè)中被廣泛用作原料藥和制劑的反應(yīng)介質(zhì)和其他步驟。溶劑生產(chǎn)和運(yùn)輸過(guò)程中添加的化學(xué)品、生產(chǎn)過(guò)程中的污染以及溶劑回收等都是商用溶劑中亞硝胺的潛在來(lái)源。USP使用島津高靈敏度的GCMS-TQ8050 NX系統(tǒng)開(kāi)發(fā)了在藥品生產(chǎn)中廣泛使用的二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯和鄰二甲苯溶劑中的六種亞硝胺的高靈敏度的檢測(cè)方法，該方法對(duì)于商用級(jí)和分析級(jí)溶劑都能實(shí)現(xiàn)滿意的檢測(cè)效果。
相關(guān)儀器
阿克級(jí)三重四極桿GCMS系統(tǒng)給您帶來(lái)好的體驗(yàn)。
01.優(yōu)異的性能
● 全時(shí)三重降噪技術(shù)有效抑制中性噪聲和干擾，獲得更高靈敏度；
● 全新設(shè)計(jì)的高靈敏度檢測(cè)器，即使應(yīng)對(duì)超痕量級(jí)樣品，也能提供很好的穩(wěn)定性，成就阿克級(jí)IDL水平。
02.智能的操作
● 基于保留指數(shù)的Smart系數(shù)據(jù)庫(kù)為不同領(lǐng)域提供全方位應(yīng)用支持，從方法創(chuàng)建到數(shù)據(jù)處理全智能。
03.耐用的硬件
● 高輝度抗污染離子源和全新長(zhǎng)壽命檢測(cè)器，確保分析工作長(zhǎng)期穩(wěn)定的進(jìn)行。
04.安全的數(shù)據(jù)管理—LabSolutions DB/CS GCMS
● 數(shù)據(jù)庫(kù)版工作站出色的數(shù)據(jù)完整性功能（DB 單機(jī)版；CS網(wǎng)絡(luò)版），進(jìn)一步滿足合規(guī)性要求；
● 兼容 GCMS-SQ和TQ、各種自動(dòng)進(jìn)樣器及島津特色Smart數(shù)據(jù)庫(kù)等，實(shí)現(xiàn)多樣化分析；
● LabSolutions CS網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，統(tǒng)一管理所有分析數(shù)據(jù)，支持多人同時(shí)在網(wǎng)絡(luò)上的任意客戶端查看并確認(rèn)數(shù)據(jù)。
聲明：文章內(nèi)容來(lái)源于島津科技咨詢通，旨在分享若涉及版權(quán)問(wèn)題，請(qǐng)及時(shí)與我司聯(lián)系，我們將快速處理。
