島津中國創(chuàng)新中心與北京大學(xué)第三醫(yī)院藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)劉東陽研究員課題組合作，基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜LC-MS/MS建立九種重要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的同時定量分析方法，有效對人體組織及器官中轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白的豐度測定。該方法在正離子模式下使用多反應(yīng)監(jiān)測模式完成，并分別進(jìn)行方法特異性、線性、準(zhǔn)確度、精密度以及穩(wěn)定性驗(yàn)證。該方法可穩(wěn)定、有效地定量分析人體組織中的9種轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白，提供可靠的檢測結(jié)果。
轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白是細(xì)胞膜上的功能性蛋白，存在于腦、肝臟、腸道、腎臟以及其他組織和器官的細(xì)胞膜表面并介導(dǎo)藥物的攝取和排出。生理或病理?xiàng)l件的變化會影響轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)，從而改變藥物在體內(nèi)的暴露，影響藥物的安全性及利用率以及疾病的治療。轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白是導(dǎo)致產(chǎn)生藥效個體化用藥差異重要因素之一。
目前針對轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白在藥物處置及藥物相互作用中發(fā)揮功能的研究吸引廣泛地關(guān)注。使用基于生理學(xué)數(shù)據(jù)建立藥代動力學(xué)模型并預(yù)測藥物的藥代動力學(xué)行為及研究藥物相互作用的方法，在給藥方案調(diào)整以及新藥研發(fā)中廣泛使用。模型中轉(zhuǎn)運(yùn)體部分參數(shù)的建立需要對轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白在人體中的表達(dá)水平進(jìn)行準(zhǔn)確的定量測定，從而獲取其豐度數(shù)據(jù)。傳統(tǒng)的蛋白定量方法主要基于放射性法或熒光免疫法進(jìn)行測定，受到抗體質(zhì)量波動或其他相關(guān)檢測因素的影響。隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，利用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)靶向及非靶向分析的研究不斷增加。液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜通過使用多反應(yīng)監(jiān)測模式(Multiple reaction monitoring, MRM)方式，有效實(shí)現(xiàn)多種蛋白的同時準(zhǔn)確定量測定，被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的定量分析。
本工作使用島津LC-30A系統(tǒng)+LCMS-8060三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行方法開發(fā)及驗(yàn)證。
圖1 島津液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜
9種目標(biāo)檢測轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白及LC-MS分析參數(shù)如下所示。
LC分離參數(shù)：
流動相A：水+0.2%甲酸；
流動相B：乙腈+0.2%甲酸；
流動相C：乙腈+0.5%乙二醇+0.2%甲酸，為提高目標(biāo)轉(zhuǎn)運(yùn)體檢測靈敏度，在柱后以0.1mL/min流速輸送流動相C
色譜柱：Shim-pack GISS-HP C18 (2.1mm*100mm, 1.9μm)
流速：0.3mL/min
柱溫：35℃
表1 LC梯度洗脫程序
質(zhì)譜檢測參數(shù)：
離子化模式：ESI，正離子模式；
霧化氣：3L/min;
干燥氣：8L/min;
加熱氣：12L/min;
接口溫度：350℃；
脫溶劑管線DL溫度：250℃；
加熱模塊溫度：400℃。
表2 目標(biāo)轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白及MRM檢測參數(shù)
圖2及表3顯示了9種轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白的代表性離子流圖及線性、檢測限結(jié)果。
圖2 9種轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白離子流圖
表3 9種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白線性及檢出限結(jié)果
本研究開發(fā)并驗(yàn)證了同時定量分析MDR1、BCRP、OATI、OAT3、OCT2、OATP1B1、OATP1B3、MATE1、MATE2K等9種細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白的方法，使用柱后補(bǔ)償乙二醇的方式有效提高轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白的檢測靈敏度，該方法具有良好的靈敏度和線性范圍，可滿足人體組織或器官中轉(zhuǎn)運(yùn)體豐度的檢測的要求。
本工作詳細(xì)內(nèi)容已由北京大學(xué)第三醫(yī)院藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)劉東陽研究員課題組發(fā)表于Separation Science Plus，DOI:10.1002/sscp.202200120
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