生物藥需要對從開發(fā)到運輸?shù)拿總€過程進行適當?shù)馁|量控制，這增加了提高分析可靠性和數(shù)據(jù)可追溯性的重要性。在液相色譜分析中由于蛋白質和腦的結構中有許多可解離基團流動相的pH值會影響高效液相色譜分析中的峰分離。因此，pH值在優(yōu)化分析條件時起著至關重要的作用。
通常，流動相的pH值只在流動相配制過程中進行檢查，但是卻忽視了分析期間pH值的變化可能會對分析性能(如分離度和重現(xiàn)性) 產(chǎn)生負面影響，特別是在長時間連續(xù)分析的情形下。另外，pH值數(shù)據(jù)可追溯性也很重要，能在分析結果不佳的原因和研判分析方法過程中提供至關重要的信息。
島津流動相pH監(jiān)測器pHM-40可以嵌合在色譜系統(tǒng)中 (圖1)，實時記錄pH值的變化。pH值信息與所有其他分析信息 (如分析條件、色譜圖和定量參數(shù))一起自動存儲在數(shù)據(jù)文件中，通過LabSolutions 軟件在色譜數(shù)據(jù)文件中隨時調用管理pH曲線，確保數(shù)據(jù)的可追溯性和可靠性。寬pH范圍 (1至14) 提供了pHM-40在各種應用中使用的可能性。
圖1 ：配置了pH監(jiān)測器的液相色譜系統(tǒng)流路圖
抗體藥物中的聚集體和片段等雜質分析通常使用體積排阻色譜法 (SEC)。在體積排阻色譜中，流動相pH可以改變單體、聚集體和片段的電荷狀態(tài)，從而改變色譜分離行為。
在本應用中，考察流動相pH值從5.7到7.2時分離狀態(tài)變化，分析過程中的pH值由pHM-40確認并疊加關聯(lián)至色譜圖，可直觀地確定理想分離狀態(tài)的pH值 (圖2、圖3)
| 表1分析條件 | |
|---|---|
| 系統(tǒng) | Nexera XS inert生物惰性高效液相色譜 |
| 色譜柱 | Shim-packTm Bio Diol-300 (150 mm x 4.6 mm l.D., 2 um) |
| 流動相 (自動混合) |
A:200mmol/L磷酸鈉緩沖液 B:200mmol/L磷酸二鈉緩沖液 C:1 mol/L 氯化鈉溶液 D:水 |
| 流速 | 0.25 mL/min |
| 柱溫 | 25℃ |
| 樣品 | 單克隆抗體標準品(500 ug/mL) |
| 進樣體積 | 5 uL |
| 檢測器 | 280 nm(SPD-M40惰性流通池) |
圖2 pH=7.2時的色譜圖
圖3 不同pH值時色譜圖的變化 (放大)
抗體藥物中的電荷異構體分析常使用離子交換色譜法。本案例為在西妥昔單抗生物類似藥的電荷異構體分析過程中，使用pHM-40進行pH值梯度監(jiān)控的應用。使用具有不同緩沖能力的HEPES，MES和乙酸鈉溶液等調節(jié)pH值，可觀察到PH值隨流動相B相濃度的增加而從PH5.5線性變化至pH 8.0左右。將流動相濃度恢復到初始濃度后，色譜圖降至基線水平 (約18分鐘)，pH值恢復到初始值。
(時間差是色譜柱根據(jù)流動相pH值的變化達到平衡后，流動相從檢測器到達pH監(jiān)測器所需的時間)測得的pH值可用于準確估算色譜柱平衡時間。
| 表2分析條件 | |
|---|---|
| 系統(tǒng) | Nexera XS inert生物惰性高效液相色譜 |
| 色譜柱 | Shim-pack Bio IEX SP-NP ( 100 mm x 4.6 mm l.D., 3 um) |
| 流動相 | A: 20 mmol/L HEPES-MES-Sodium acetate (pH 5.0) B: 20 mmol/L HEPES-MES-Sodium acetate (pH 8.2) |
| 梯度程序 | B Conc.0%(0-0.5 min) - 100%(0.5-10 min) - 0%(15.1-25 min) |
| 流速 | 0.6 mL/min |
| 柱溫 | 25℃ |
| 樣品 | 西妥昔單抗生物類似藥(1 mg/mL) |
| 進樣體積 | 5 uL |
| 檢測器 | 280 nm(SPD-M40,惰性流通池) |
圖4 西妥昔單抗色譜圖 (含流動相濃度梯度曲線和pH曲線
1）蛋白質和腦的分析，很容易受到流動相pH值的影響，因此有必要在分析過程中監(jiān)測流動相pH值。
2）pH曲線可以很容易地疊加在色譜圖上，使所得數(shù)據(jù)文件更加完整，并提高數(shù)據(jù)的可追溯性和可靠性。
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